Nature Biotechnology杂志2012年9月期刊登了一篇题为“RNA-mediated programmable DNA cleavage”的文章，介绍了基因组工程领域的一个新工具，即RNA介导的可编程DNA剪切，它可以用于重新编程定制的小型、非编码RNA。

基因组工程方法依赖于位点特异的核酸内切酶在剪切位点通过DNA修复系统触发序列修改。目前在基因组工程广泛应用的酶包括锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应因子核酸酶（TALEN）。在Science最近的一篇文章3中Jinek等发现两个RNA分子指导核糖核蛋白复合物中DNA裂解（核糖核蛋白复合物形成了细菌适应性免疫系统的一部分），同时一个单一的RNA嵌合体可被设计为重新编程序列的特异性。这种合成的杰作为基因组工程宝库引入了一个新的核酸内切酶家族，实现合成的RNA介导的剪切特异性的重编程。可以预见这种方法的几个直接应用，特别是在基因组工程和编辑中定制单链DNA缺刻（nicking）和双链DNA剪切中的应用。

在Jinek等的研究中，分子工具是成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）的部分片段，CRISPR与CRISPR相关基因（cas）构成了CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas提供了在细菌和古细菌中RNA介导的对病毒和质粒的适应性免疫。CRISPR间区序列（CRISPR spacers）按照一定顺序转录并加工成小分子干扰CRISPR RNA（crRNA），引导Cas蛋白介导的同源双链DNA序列切割。

根据cas基因含量和序列确定了CRISPR-Cas系统的三种类型，这三种类型中，类型I和III要引起免疫性，依赖于一个大型的多蛋白Cas复合物，而类型II系统只依靠单一Cas蛋白—Cas9蛋白。虽然目标序列是由CRISPR的间区序列确定的；但许多CRISPR-Cas系统中严格要求要在间区序列目标的紧邻处有一个原型间区序列相关的基序（PAM）序列，通常是2-4个核苷酸。

图1 crRNA指导Cas9剪切DNA

Jinek等研究表明，在细菌中Cas9-crRNA核蛋白复合物为细菌中CRISPR编码的免疫性介导特异性DNA剪切。一个反式激活的CRISPR RNA（crRNA），称为tracrRNA，与另一个独特的crRNA配对，引导Cas9到同源靶序列（图1a）。研究人员进一步证明，Cas9的核酸内切酶HNH 和RuvC区域分别剪切互补和非互补的DNA链，产生平滑剪切的双链DNA。这种在DNA序列的确定和不连续的位置上剪裂或剪切DNA的能力为在体外编辑和组装DNA序列开辟了新途径。随后，在一个完善的概念验证实验中，结果表明Cas9 DNA剪切特异性（crRNA和目标DNA之间最小定义为13-nt的碱基配对）可以被重新编程以靶向绿色荧光蛋白基因，这些基因将crRNA的3'末端与tracrRNA的5'末端融合，形成RNA嵌合体（图1b）。由此形成的Cas9复合物结合了RNA灵活性和DNA限制性内切酶的能力，能在基因组靶向定位或编辑中导致DNA单链或双链断裂。

与ZFN和TALEN相比，嵌合的RNA-Cas9系统拥有几个优点，包括：1）序列识别特异性；2）PAM二核苷酸产生的频率更高；3）相对于修改蛋白序列中的氨基酸，能更方便地重新设计核酸的核苷酸序列；4）能剪切任何一个DNA单链或DNA双链，嵌合的RNA-Cas9系统通过可编程的DNA剪切酶，可以开展分子水平的精确的基因组编辑；5）由于Cas9有两个不同的域（RuvC和HNH），每一个可以剪切一个特定的DNA链；6）野生型Cas9和功能结构域突变体能产生所需的DNA双链或单链断裂（图1b）。与传统方法容易出错、非同源、双链DNA剪切的端部接合修复不同，单链断裂能在断裂位点通过无差错的同源重组修复，产生精确的突变。

对Cas9剪切的分子分析表明，Cas9剪切能够切割线性和超螺旋DNA，这表明RNA嵌合体可同时或先后在多个目标位点使用一个酶处理DNA，使基因组叠加和重组成为可能。因此，crRNA-Cas引导的剪切为精确的DNA改造和基因组编辑创造了条件。

尽管这个新工具的直接应用包括在细菌中个性化定制DNA剪切，但在真核细胞的基因组编辑和基因组工程中应用更有前途。这将需要测试crRNA-Cas系统是否可以在体内有效地剪切染色质DNA并很容易地转移到感兴趣的生物体中，特别是酵母和真菌中，以及植物中。这种新的剪切工具是否能超越现有的ZFN和TALEN方法，还有需要时间和实践来验证。

（信息来源：中国科学院）